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1.4 心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)含量的測(cè)定(改良Lowry法) 6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)的心肌細(xì)胞，加入1 mg/ml牛血清白蛋白，用雙蒸水定容至2.98 ml。按操作步驟處理后，用紫外分光光度計(jì)660 nm比色，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定細(xì)胞總蛋白質(zhì)含量。
1.5 心肌細(xì)胞大小的測(cè)定 心肌細(xì)胞加藥持續(xù)5天后，用胰酶消化使之脫落，在相差顯微鏡下拍照。每孔取10個(gè)視野，每個(gè)視野取10個(gè)細(xì)胞，采用HJ2000通用圖像分析系統(tǒng)，通過標(biāo)尺測(cè)量細(xì)胞表面積，取平均值。
1.6 CCK-8法檢測(cè)心肌細(xì)胞活性 96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)的心肌細(xì)胞，每孔加入10 μl CCK-8(5 g/L)溶液，37 ℃孵育1~2 h，采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)測(cè)OD值(A)，OD值的大小反映活細(xì)胞的數(shù)量。
1.7 Western Blot檢測(cè) 取心肌細(xì)胞的蛋白提取液進(jìn)行10%SDS-PAGE分離，考馬斯亮藍(lán)染色、脫色至背景清晰。電泳結(jié)束后，進(jìn)行電轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移后的PVDF膜切取標(biāo)準(zhǔn)蛋白泳道進(jìn)行膜染色。其余用洗膜緩沖液洗5 min，用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉，洗膜，浸入一抗(1∶200)，4 ℃過夜。液膜浸入二抗(1∶1 000)，定溫孵育2 h。洗膜，ECL試劑顯色。用四星圖像分析系統(tǒng)測(cè)定Western Blot蛋白條帶的灰度值，計(jì)算目的條帶和內(nèi)參條帶的比值。分別以α1C、α1G、α1H帶與β-actin帶灰度比表示α1C、α1G、α1H蛋白相對(duì)含量。
1.8 鈣成像試驗(yàn) 將培養(yǎng)的心肌細(xì)胞吸去培養(yǎng)液，用終濃度5 μmol/L的Fluo-3/AM溶液染色，進(jìn)行Fluo-3/AM負(fù)載，采用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行鈣離子濃度基線掃描。通過共聚焦顯微掃描分析胞內(nèi)游離Ca2+濃度動(dòng)態(tài)的變化。
1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Origin7.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用進(jìn)行方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié) 果
2.1 不同濃度SIM對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的影響 見表1。AngⅡ+SIM(10-8～10-7 mol/L)組心肌細(xì)胞總蛋白含量較AngⅡ組均無明顯變化(P>0.05)。表明10-6～10-4 mol/L終濃度的SIM均能有效抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞蛋白合成增加，其中10-6 mol/L SIM為抑制AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞蛋白合成增加的最適有效濃度。
2.2 SIM、Ver對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的影響
見表2。AngⅡ+SIM+MVA組蛋白含量及細(xì)胞表面積與AngⅡ組比較則無明顯變化(P>0.05)。表明SIM能有效抑制心肌細(xì)胞蛋白合成的增加及細(xì)胞表面積的增加，且與Ver作用相似，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MVA則拮抗了SIM對(duì)心肌細(xì)胞蛋白合成以及細(xì)胞表面積的增加的抑制作用醫(yī)學(xué) 全在.線提供m.f1411.cn。
2.3 SIM對(duì)心肌細(xì)胞活力的影響 AngⅡ組A450nm值與對(duì)照組比較明顯下降(P<0.01);同時(shí)分別給予10-8～10-4 mol/L SIM或者Ver干預(yù)，結(jié)果表明給予10-6～10-4 mol/L SIM或Ver處理后，A450nm值顯著高于AngⅡ組(P<0.01)，但給予10-8～10-7mol/L SIM后，A450nm值與AngⅡ組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);AngⅡ+SIM+MVA組與AngⅡ組比較亦差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示AngⅡ可誘導(dǎo)細(xì)胞活力顯著下降，應(yīng)用10-6～10-4 mol/L SIM和Ver均可顯著提高心肌細(xì)胞活力，其中10-6 mol/L SIM的作用效果最佳(P<0.01)，而MVA則抑制了SIM對(duì)心肌細(xì)胞活力增強(qiáng)的作用(圖1)。
2.4 SIM對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞鈣通道蛋白表達(dá)的影響 各實(shí)驗(yàn)組L-型鈣通道亞單位α1C蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。AngⅡ組與對(duì)照組相比，α1G、α1H蛋白表達(dá)均明顯增加(P<0.01);AngⅡ+SIM組、AngⅡ+Ver組α1G、α1H蛋白表達(dá)較AngⅡ組均顯著下降(P<0.01);AngⅡ+SIM組和AngⅡ+Ver組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);而AngⅡ+SIM+MVA組與AngⅡ組比較，α1G、α1H蛋白表達(dá)無明顯差異(P>0.05)(圖2，3)。結(jié)果表明，AngⅡ誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞T-型鈣通道亞單位α1G、α1H蛋白表達(dá)均明顯增加。SIM或Ver對(duì)心肌細(xì)胞肥大引起的T-型鈣通道α1G、α1H蛋白表達(dá)增加均具有明顯的抑制作用，且二者作用效果相似，而MVA則拮抗了SIM對(duì)α1G、α1H蛋白表達(dá)的抑制作用。SIM或Ver對(duì)L-型鈣通道亞單位α1C蛋白表達(dá)則無明顯影響。
2.5 SIM對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞鈣離子超載的影響 AngⅡ組心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度明顯升高;當(dāng)同時(shí)加入SIM時(shí)，則明顯抑制了AngⅡ引起的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高, 且這種抑制作用具有濃度依賴關(guān)系，其中SIM 10-6 mol/L時(shí)作用最顯著(P<0.01);而AngⅡ+SIM+MVA組心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度與AngⅡ組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);Ver陽(yáng)性對(duì)照組與AngⅡ組比較鈣離子濃度明顯降低(P<0.01)(圖4，見封二)。結(jié)果表明，10-6～10-4 mol/L SIM均能明顯抑制AngⅡ引起的心肌細(xì)胞鈣超載，其作用與Ver相似，提示SIM可能與Ver一樣，均通過阻斷鈣通道降低心肌細(xì)胞鈣超載而發(fā)揮作用，而MVA則拮抗了SIM對(duì)心肌細(xì)胞鈣超載的抑制作用。
3 討 論
業(yè)已證明，AngⅡ具有生長(zhǎng)因子樣作用，是刺激心肌肥大的主要生物活性物質(zhì)之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞中加入AngⅡ作用一定時(shí)間后，心肌細(xì)胞蛋白合成及心肌細(xì)胞表面積均明顯增加，這一結(jié)果與本課題組以往的研究及其它文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果是一致的[2]，表明本研究采用AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵殉晒ⅰ?/P>
