 |
 |
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑和儀器
一月齡新西蘭兔;小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3(美國(guó)邁阿密大學(xué)外科實(shí)驗(yàn)室);DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司);小牛血清(杭州四季青生物技術(shù)材料研究所);胰蛋白酶(Sigma公司);多聚季胺(polybrene)儲(chǔ)用液(8g/L)(Sigma公司);G418儲(chǔ)用液(50g/L)(GIBCO/BRL);CO2培養(yǎng)箱、無菌超凈臺(tái)、離心機(jī)、倒置顯微鏡。
1.2 細(xì)胞株和質(zhì)粒
人293T細(xì)胞、293/GPG包裝細(xì)胞系由余紅博士饋贈(zèng);pCnBgSN[3]是lacZ基因的表達(dá)質(zhì)粒;質(zhì)粒pHIT60[4]是鼠白血病逆轉(zhuǎn)錄病毒(murineleukemia retrovirus, MuLV)Gag和Pol蛋白的表達(dá)質(zhì)粒;質(zhì)粒pCVG[2]是皰疹性口炎病毒G糖蛋白(vesicular stomatitis virus G glycoprotein, VSVG)的表達(dá)質(zhì)粒。所有質(zhì)粒由美國(guó)邁阿密大學(xué)外科實(shí)驗(yàn)室余紅博士提供。所有質(zhì)粒DNA均用大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(TIANGEN BIOTECH)擴(kuò)增，并用試劑盒(Valencia, CA)從大腸桿菌中提取。
1.3 方法
1.3.1 SMC的分離培養(yǎng)
一月齡大耳白兔用水合氯醛腹腔注射麻醉后，在無菌條件下，迅速將頸內(nèi)靜脈取出，盛入有PBS液的平皿中。洗凈血塊，剝除外膜，將血管翻轉(zhuǎn)內(nèi)膜面朝外，用刀片自上而下刮1～2遍，去除VEC。然后用顯微鑷撕下血管中膜的平滑肌層，將其剪碎(0.5～1mm3)，接種于培養(yǎng)瓶中，在CO2培養(yǎng)箱中放置2.5～3.0h，使組織塊較牢固地黏附于瓶壁，加入含200mL/L新生牛血清的DMEM(Dulbeccos modified Eagles medium, DMEM, Gibco)培養(yǎng)液，3～4d更換培養(yǎng)液一次。細(xì)胞生長(zhǎng)形成致密單層時(shí)，用1.25g/L胰蛋白酶消化，按1∶2比例傳代培養(yǎng)，5～6d可繼續(xù)傳代一次[5]。實(shí)驗(yàn)采用第2～4代細(xì)胞進(jìn)行研究醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站m.f1411.cn。
1.3.2 小鼠成纖維細(xì)胞(NIH3T3)的培養(yǎng)
含100mL/L滅活胎牛血清(杭州四季青生物制品研究所)，2mmol/L谷氨酰胺，100mg/L青霉素及100mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，置37℃，50mL/L CO2，飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天半量換液，細(xì)胞為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，存活細(xì)胞百分率95%(臺(tái)盼藍(lán)拒染法)，備用。
1.3.3 兩型逆轉(zhuǎn)錄病毒的生產(chǎn)
MuLV及MuLV/VSVG載體均參考三個(gè)質(zhì)粒短暫轉(zhuǎn)染體系[3]方法生產(chǎn)，二者均含有β2半乳糖苷酶報(bào)道基因。293T/17細(xì)胞(美國(guó)邁阿密外科基因?qū)嶒?yàn)室凍存，1×106個(gè)細(xì)胞/10cm直徑培養(yǎng)皿)。采用改良磷酸鈣沉淀轉(zhuǎn)染法。MuLV加入質(zhì)粒DNA pCnBgSN，pHIT60和pCAE各10μg;MuLV/VSVG則加入質(zhì)粒pCnBgSN，pHIT60和pCVG各10μg，轉(zhuǎn)染16h后將細(xì)胞培養(yǎng)液更換為含有10mmol/L sodium butyrate(Sigma)的培養(yǎng)基，12h后，以6mL新鮮培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，以生產(chǎn)病毒，培養(yǎng)12h后，收獲含有病毒顆粒的上清，0.4μm的濾器過濾后分裝，-70℃保存，備病毒滴度測(cè)定及轉(zhuǎn)導(dǎo)。
1.3.4 VSVG/MuLV濃度的測(cè)定
采用G418克隆篩選法[6]：①第1天，將NIH3T3細(xì)胞放入30mm的六孔板中(5×104細(xì)胞/孔);②第2天，將病毒上清液與多聚季胺混存(終濃度為8mg/L)，滴度測(cè)定時(shí)以含有多聚季胺的DMEM培養(yǎng)液以1∶10梯度稀釋上清，循六孔板以1～6孔序號(hào)形成10-1～10-6個(gè)稀釋濃度;③第3天，以3mL含0.8g/L G418的DMEM培養(yǎng)液用作G418選擇測(cè)試;④G418篩選，細(xì)胞以含0.8g/L G418的培養(yǎng)液培養(yǎng)7d后，棄去培養(yǎng)液，細(xì)胞以100mL/L甲醛固定后用PBS洗滌3遍，培養(yǎng)皿中的細(xì)胞以1mL含10g/L美藍(lán)的甲醛染色5min后用自來水沖洗，對(duì)未被洗去顏色的細(xì)胞以克隆為單位進(jìn)行計(jì)數(shù)。病毒滴度即為染色細(xì)胞克隆的數(shù)目(稀釋系數(shù)/所加病毒的體積)。
1.3.5 假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)SMC
①第1天將SMC以3×104個(gè)/孔接種于直徑為30mm的6孔板中;②第2天SMC生長(zhǎng)至約70%～80%融合后，加病毒上清0.5mL(含8mg/L多聚季胺)孵育2h后添加2mL新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)后行Xgal染色。
2 結(jié)果
2.1 SMC鑒定
VSMC行抗α肌動(dòng)蛋白SABC法免疫組織化學(xué)染色鑒定。組織化學(xué)染色呈陽性，在細(xì)胞胞漿內(nèi)可見細(xì)胞的肌絲被染成棕黃色(圖1)。
