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1.2 膜片嵌全細(xì)胞記錄
采用標(biāo)準(zhǔn)式全細(xì)胞記錄。將內(nèi)沖過(guò)電極內(nèi)液的玻璃微電極(尖端1～2μm，阻抗2～5MΩ)連接于電極支持裝置，取上述制備好的心肌細(xì)胞懸液數(shù)滴滴于灌流槽中，置于生物倒置顯微鏡下(Olympus，日本)，待細(xì)胞沉底附壁后，用鈉灌流液灌流，灌流速度2mL/min，沖去死亡細(xì)胞碎片，選取表面光潔、橫紋清晰的心肌細(xì)胞作為研究對(duì)象。采用三維液壓微操縱器靠近細(xì)胞進(jìn)行封接，封接阻抗1GΩ以上，吸破細(xì)胞膜形成全細(xì)胞記錄模式。脈沖信號(hào)由Digidata 1320A(美國(guó)Axon)放大器控制，數(shù)據(jù)由pClamp8軟件采集、分析。數(shù)據(jù)經(jīng)計(jì)算機(jī)自動(dòng)分析后儲(chǔ)存于計(jì)算機(jī)硬盤(pán)中。
1.3 藥品與試劑
雷諾嗪(CV Therapeutics公司，美國(guó))，膠原酶Ⅰ、蛋白酶、EGTA、HEPES均為Sigma公司產(chǎn)品。試劑的配制：①無(wú)鈣臺(tái)氏液(mmol/L)：NaCl 125、KCl 3.5、K2HPO4 1.5、MgCl2 1、NaHCO3 20、HEPES 5，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4;②KB液(mmol/L)：L-谷氨酸(L-Glutamic Acid) 80、K2HPO4 20、KCl 20、MgCl2 5、K2EGTA 0.5、Na2ATP 2、丙酮酸(Pyruvic Acid) 5、肌酸(Creatine)5、�；撬�(Taurine) 20、甘氨酸(Glycine) 10、HEPES 5、Glucose 10，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.3;③INa電極內(nèi)液(mmol/L)：NaCl 10、CsF 110、CsCl 20、EGTA 5、HEPES 5、ATP-Mg 5，用CsOH調(diào)節(jié)pH至7.4;④鈉灌流液(mmol/L)：CsCl 130、MgCl2 1.0、NaCl 10、CaCl2 1.0、HEPES 5、Glucose 10、CdCl2 0.3 用CsOH調(diào)節(jié)pH至7.4。所有實(shí)驗(yàn)在室溫(20～25℃)下進(jìn)行。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
采用細(xì)胞外給藥的方法，給藥后5min觀察指標(biāo)的變化。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)處理均應(yīng)用SPSS11.5軟件包進(jìn)行。計(jì)量資料以±s表示，實(shí)驗(yàn)在同一細(xì)胞進(jìn)行，用自身對(duì)照t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié) 果
2.1 雷諾嗪對(duì)INa的影響
維持電壓(holding potential)在-100mV，指令電壓-80mV～+40mV，步長(zhǎng)20mV，鉗制時(shí)間80ms，刺激頻率0.5Hz，引出INa;以不同鉗制電壓下的電流密度繪成電流-電壓(Ⅰ～Ⅴ)關(guān)系曲線，然后給予30μmmol/L雷諾嗪灌流5min，重復(fù)上述操作。30μmmol/L雷諾嗪可顯著抑制INa的峰電流，INa電流密度峰值(鉗制電位-40mV時(shí))由灌流前的(33.42±4.33)pA/pF(n=6)降至灌流后的(13.4±4.43)pA/pF(n=6，P<0.01)，其IC50為(25.6±1.8)μmmol/L(圖1)。
2.2 雷諾嗪對(duì)INa-T的頻率依賴性和使用依賴性
INa的使用依賴性測(cè)定：保持電位從-100mV～-40mV，給予1Hz、3.3Hz和5Hz不同刺激頻率(刺激間期分別1000ms、300ms和200ms)，脈寬10ms，脈沖20個(gè)。3種刺激頻率在同一細(xì)胞完成，給予不同刺激頻率時(shí)時(shí)間隔2min。結(jié)果顯示，30μmmol/L雷諾嗪灌流后，3.3Hz連續(xù)20個(gè)脈沖所產(chǎn)生的INa電流呈逐漸減少趨勢(shì)，最后達(dá)穩(wěn)態(tài)水平(圖2A);隨著刺激頻率的增加對(duì)INa電流阻斷也加大，說(shuō)明存在使用依賴性(圖2B);隨著藥物濃度的增加和刺激頻率的加大對(duì)INa電流的阻斷逐漸加強(qiáng)(圖2C);隨著刺激頻率的增加對(duì)INa電流阻斷IC50逐漸減少，說(shuō)明該藥亦存在頻率依賴性(圖2D)醫(yī).學(xué)全.在.線m.f1411.cn。
3 討 論
