實(shí)驗(yàn)五 血痕檢驗(yàn)
一、血痕預(yù)試驗(yàn)
【目的要求】
熟悉掌握聯(lián)苯胺試驗(yàn)的原理和方法；了解其它檢測(cè)血痕預(yù)試驗(yàn)的原理及方法。
【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】
檢驗(yàn)血痕應(yīng)先作預(yù)試驗(yàn)，包括聯(lián)苯胺試驗(yàn)、酚肽試驗(yàn)、愈創(chuàng)木酯試驗(yàn)、孔雀綠試驗(yàn)、鄰聯(lián)甲苯胺試驗(yàn)、氨基比林試驗(yàn)、魯米諾試驗(yàn)、紫外線濃硫酸試驗(yàn)及紙色譜法等。血痕預(yù)試驗(yàn)的基本原理是血痕中的血紅蛋白或正鐵血紅素具有過氧化物酶活性，遇H2O2可使之分解成H2O與新生態(tài)氧，后者可使某些化學(xué)物質(zhì)氧化，形成氧化產(chǎn)物而呈顏色反應(yīng)。某些植物汁中也含有某種具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，可使預(yù)試驗(yàn)發(fā)生陽性反應(yīng)。氧化劑也可直接氧化某些化學(xué)物質(zhì)，故預(yù)試驗(yàn)陽性只能說明被檢斑痕可能是血痕，但不能確證為血痕，陰性則可排除血痕。
（一)儀器設(shè)備及試劑
1．儀器設(shè)備
剪刀、凹玻片
2．試劑
（1)聯(lián)苯胺無水乙醇飽和液
取聯(lián)苯胺1g置于棕色瓶內(nèi)，加20ml無水乙醇，置于50℃溫箱中2h助溶，然后降至室溫。此時(shí)大部分聯(lián)苯胺已溶解，上清液即為聯(lián)苯胺無水乙醇飽和液，置于4℃冰箱種備用。
（2)冰醋酸
（3)3%過氧化氫
（二)檢材
血痕、果汁斑、唾液斑、植物汁斑、高錳酸鉀、尿液、痰液
（三)聯(lián)苯胺試驗(yàn)原理
血痕中的血紅蛋白或正鐵血紅素具有過氧化物酶活性，能使H2O2分解成H2O與新生態(tài)氧，后者使聯(lián)苯胺氧化成翠藍(lán)色的聯(lián)苯胺蘭。
（四)實(shí)驗(yàn)方法
1．剪取或刮取檢材少許，置凹玻片孔內(nèi)或小濾紙片上。
2．加冰醋酸1滴，然后加聯(lián)苯胺無水乙醇飽和液1滴。
3．1-2分鐘后，若不出現(xiàn)蘭色反應(yīng)，再加3%H2O2 1滴，立即出現(xiàn)翠蘭色為陽性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)。
4．血痕與唾液斑、果汁斑、植物汁斑、尿液、痰液、高錳酸鉀等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并進(jìn)行討論。
【注意事項(xiàng)】
1．必須嚴(yán)格遵守加試劑的順序
2．本試驗(yàn)方法靈敏，微量檢材即夠，嚴(yán)禁在檢材上滴加試劑作反應(yīng)，以免破壞檢材。
3．取檢材時(shí)，應(yīng)防止相互污染。
【思考題】
1．苯胺試驗(yàn)陽性，是否證明檢材含有血？為什么？
2．本試驗(yàn)為什么必須嚴(yán)格遵守加試劑的順序？
二、血痕確證試驗(yàn)
【目的要求】
熟悉掌握高山氏結(jié)晶試驗(yàn)的原理和方法；了解其它檢測(cè)血痕確證試驗(yàn)的原理及方法。
【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】
確證試驗(yàn)的目的是確證檢材是否為血，主要依據(jù)是檢材中是否含有血紅蛋白或其衍生物。
（一) 儀器設(shè)備及試劑
1． 儀器設(shè)備
載玻片、分離針、小刀、蓋片、顯微鏡。
2．試劑
高山氏試劑：混合10% NaOH 3ml，30%葡萄糖10ml，吡啶3ml，置于棕色滴瓶內(nèi)。放4℃冰箱12-24小時(shí)即可使用，如果試劑放置過久，將會(huì)失效。
（二)原理
血痕中的血紅蛋白在堿性溶液中分解為正鐵血紅素和變性珠蛋白，在還原劑葡萄糖的作用下，正鐵血紅素還原成血紅素，與變性珠蛋白或其它含氮化合物如吡啶結(jié)合，形成血色原結(jié)晶。
（三)實(shí)驗(yàn)方法
1. 取檢材少許（如系織物，取纖維1－2mm，如系血痂，刮下1－3mm)置于玻片上，用分離針將纖維分離或?qū)⒀鑹核椤?/P>
2．蓋上蓋玻片，沿蓋片邊緣滴加試劑1至2滴（不要擠壓或移動(dòng)蓋玻片)，鏡檢，產(chǎn)生橙紅色星狀，菊花狀或針狀的結(jié)晶，為陽性反應(yīng)。
【注意事項(xiàng)】
1．本法操作簡便。缺點(diǎn)是試劑容易失效，出現(xiàn)假陰性結(jié)果。一般檢驗(yàn)以前，先用已知血痕試驗(yàn)，出現(xiàn)陽性結(jié)果，說明該試劑可以使用，反之不能使用。
2. 無結(jié)晶形成，可將玻片置于酒精燈上稍加熱，促使結(jié)晶形成，冷后鏡檢，或?qū)⒉Ｆ檬覝刂?0min，再行檢驗(yàn)。
三、血痕的種屬鑒定
【目的要求】
熟悉掌握環(huán)狀沉淀反應(yīng)的原理和方法；了解其它檢測(cè)血痕種屬試驗(yàn)的原理及方法。
【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】
血痕種屬鑒定是血痕檢驗(yàn)的關(guān)鍵步驟之一，種屬鑒定有許多方法，包括血清學(xué)方法、細(xì)胞學(xué)方法、分子生物學(xué)方法及生物化學(xué)方法。以血清學(xué)的沉淀反應(yīng)最為簡便實(shí)用。
（一)儀器設(shè)備及試劑
1. 儀器設(shè)備
毛細(xì)吸管、小試管、沉淀管、小燒杯、試管架、沉淀架、小剪刀、鑷子、大頭針、顯微鏡、離心機(jī)、水浴鍋。
2. 試劑
抗人血清、抗人血紅蛋白血清，生理鹽水，發(fā)煙硝酸，5%冰醋酸，5%黃血鹽（亞鐵氰化鉀)溶液。
（二)實(shí)驗(yàn)方法
1. 血痕浸出液的制備
(1) 取血痕檢材0.5cm2，剪碎置試管內(nèi)，加0.5ml生理鹽水，浸泡血痕2-12小時(shí)。離心，吸取上清即為血痕浸出液。血痕浸出液應(yīng)澄清、透亮、呈淡草黃色。
(2) 血痕浸出液蛋白含量的測(cè)定：
Ⅰ. 觀察浸出液衛(wèi)生資格考試網(wǎng)的顏色，如呈淡執(zhí)業(yè)藥師草黃色相當(dāng)于1/1000。
Ⅱ. 猛烈震蕩浸漬液，若液面上產(chǎn)生的泡沫能持續(xù)10秒，蛋白濃度約為1/1000。
(3) 黃血鹽冰醋酸法稀釋血痕浸出液
I. 取試管20支，分兩排放置于試管架上；
II. 將上次的血痕浸出液離心沉淀后，在第一排試管中 以二、五稀釋法稀釋。
III. 將第一排各管中的稀釋液，從后向前依次吸出1/2放入相對(duì)的第二排管中。
IV. 在第一排各管中，逐管加入5%黃血鹽溶液和5%冰醋酸各1滴，觀察在哪一管混濁剛剛消失，即該管含蛋白量相當(dāng)于1/1000，用二五稀釋人血清至5000倍，作為對(duì)照。
(4) 硝酸毛細(xì)管法稀釋血痕浸出液
I. 如上所述，用二、五稀釋法將檢材浸液作適量稀釋
II. 用毛細(xì)管插入血痕浸出液中，待液面上升到1-1.5cm 時(shí)取出，用棉球輕輕擦去管外液體。
III. 在將此毛細(xì)管插入到發(fā)煙硝酸中，取出后襯一黑紙，觀察兩液面接觸處，有無白色混濁。
IV. 依次逐管稀釋，至二液接觸面有很薄的白環(huán)，并略帶云霧狀，該管的含蛋白量約為1/1000。
2. 環(huán)狀沉淀反應(yīng)
(1) 取沉淀管1支，加入抗人血紅蛋白（或抗人血清)沉淀素血清約0.1ml。
(2) 吸取經(jīng)測(cè)定蛋白含量約1/1000（或低于1/1000)檢材浸出液小心地重疊于抗血清上。
(3) 立即觀察沉淀管內(nèi)兩液體之間的界面有無白環(huán)出現(xiàn)，再經(jīng)5、10、15、30、60分鐘各觀察一次，如在60分鐘時(shí)仍無白環(huán)出現(xiàn)即為陰性。
(4) 取無血痕部位的空白檢材，已知人血痕、動(dòng)物（如雞、豬血痕等，用同樣的方法制備浸出液，同法進(jìn)行沉淀試驗(yàn)，以保證種屬試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。
一個(gè)完整的種屬試驗(yàn)應(yīng)當(dāng)包括必要的對(duì)照和當(dāng)?shù)爻Ｒ姷幕蚺c檢案有關(guān)的動(dòng)物血痕：血痕浸出液、無血痕空白檢材浸出液、已知人血痕浸出液、生理鹽水、動(dòng)物血痕1浸出液、動(dòng)物血痕2浸出液。
3. 抗人血紅蛋白（或抗人血清)瓊脂糖免疫擴(kuò)散試驗(yàn)
（1) 剪取1mm長的學(xué)血痕纖維備用。
（2) 把瓊脂糖凝膠放于沸水浴中使其溶解。
（3) 用小燒杯一只，盛少許熱水（約60℃)把小試管一只放入燒杯中，用兩支口徑相同的毛細(xì)吸管分別按3:1的比例把人血紅蛋白沉淀素血清和瓊脂糖凝膠加于試管（即3滴血清1滴瓊脂糖混勻后，即吸出一滴于載玻片上（成一圓點(diǎn)狀)迅速用鑷子夾取血痕纖維埋于瓊脂糖中央并在纖維面上補(bǔ)加瓊脂糖血清少許。
（4) 待瓊脂糖凝固后，把玻片放于濕盒中，在15、30、60分鐘時(shí)把玻片取出，在暗背景斜光照的條件下，觀察血痕纖維周圍的瓊脂糖內(nèi)是否有圓形、橢圓形、啞鈴型或弧形的灰白色的沉淀環(huán)出現(xiàn)，若血痕太陳舊或太淡薄，則觀察時(shí)間可延長至24小時(shí)。
（5) 24小時(shí)內(nèi)有暈環(huán)出現(xiàn)為陽性，否則為陰性。
每次檢驗(yàn)均以空白檢材、已知人血痕和動(dòng)物血痕作為對(duì)照。
