第三節(jié) 發(fā)病機(jī)制
大量實(shí)驗(yàn)與臨床研究證實(shí)，缺血—再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制與活性氧大量產(chǎn)生、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、中性粒細(xì)胞活化和高能磷酸化合物生成障礙等有關(guān)。
一、活性氧的作用
(一)活性氧的基本概念
活性氧(reactiveoxygen)是指化學(xué)性質(zhì)活潑的含氧代謝物，包括氧自由基、單線態(tài)氧(1O2)、H202、NO、脂氫過氧化物(LOOH)及其裂解產(chǎn)物L(fēng)O·和LOO·等(表7—1)。
自由基(freeradical)是指外層軌道上含有單個(gè)不配對(duì)電子的各種原子、原子團(tuán)或分子。以氧為中心的自由基稱氧自由基。氧自由基包括：超氧陰離子自由基(O2-)和羥自由基(·OH)。O2-是O2的單電子還原產(chǎn)物，主要來源于線粒體，是體內(nèi)氧自由基存在的主要形式。在Cu2+或Fe2+的作用下，O2-與H2O2反應(yīng)生成·OH，即O2-+H202→(Fe2+或Cu2+)→O2+·OH+OH-。這就是所謂Fenton反應(yīng)。 ·OH是體內(nèi)最活躍的氧自由基，對(duì)機(jī)體危害亦最大。
單線態(tài)氧(1O2)是一種激發(fā)態(tài)氧，其氧分子兩個(gè)外層軌道中的一個(gè)電子發(fā)生反向自旋改變，使外層軌道兩電子自旋方向相反，氧分子的反應(yīng)能力大大增加。這種氧分子在紫外光譜中呈現(xiàn)一條單線，故稱為單線態(tài)氧(single oxygen)。單線態(tài)氧是處于不穩(wěn)態(tài)的氧，化學(xué)性質(zhì)極其活潑，能迅速氧化許多分子，包括細(xì)胞膜上多不飽和脂肪酸，對(duì)機(jī)體所起的生物學(xué)作用與自由基相同。
H202本身不是自由基，但在Cu2+或Fe2+的作用下可生成·OH，或通過均裂生成·OH。這是H202導(dǎo)致氧化應(yīng)激的主要機(jī)制。
NO是L—精氨酸(L—arginine)在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOSwww.med126.com)催化下產(chǎn)生的，它有一個(gè)不配對(duì)電子，故也是一種氣體自由基，它還能與其他自由基反應(yīng)，生成新的毒性更強(qiáng)的自由基，如過氧亞硝酸根(ONOO-)、過氧亞硝酸(HOONO)和·OH，見下式：
NO+O2- ——(e-+H+)→ONOO- ——H+→HOONO·OH十N02
過氧亞硝酸根氧化性很強(qiáng)，能擴(kuò)散到鄰近細(xì)胞造成細(xì)胞損傷；過氧亞硝酸不穩(wěn)定，能釋放出·OH和NO2。
NO作用于基可使與能量代謝、抗氧化和DNA合成有關(guān)的酶失活，但這學(xué)要較高的濃度，可能由誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS)介導(dǎo)。
脂性自由基為氧自由基與多不飽和脂肪酸作用后生成的中間代謝產(chǎn)物，包括烷氧自由基（LO·)和烷過氧自由基（LOO·)。
（二)、缺血-再灌注時(shí)活性氧增多的機(jī)制
許多研究顯示，再灌注數(shù)秒鐘后，組織和血液中的活性氧就可增多加數(shù)倍。在缺血期，組織含氧量減少，作為電子受體的氧不足，活性氧增加不顯著。當(dāng)再灌注提供氧的同時(shí)，也提供了大量電子受體，使氧自由基在短時(shí)間內(nèi)爆發(fā)性增多。此外，體內(nèi)清除活性氧的能力不足也是原因之一。
1.線粒體內(nèi)單位電子還原生成氧自由基增加 在生物氧化過程中，O2接受1個(gè)電子生成O2-，接受2個(gè)電子生成H2O2，接受3個(gè)電子生成·OH，接受4個(gè)電子生成H2O。其反應(yīng)如下：
O2—e- → O2-—e-+2H+ →H2O2↓—e-+H+ →·OH—e-+H+ →H2O
H2O
在正常情況下，細(xì)胞線粒體內(nèi)的98%的O2在細(xì)胞色素氧化酶作用下通過獲得4個(gè)電子還原成水，不形成氧自由基，僅1%~2%的O2經(jīng)單電子還原為O2-。據(jù)研究，每天每個(gè)線粒體產(chǎn)生的氧自由基可達(dá)107個(gè)，但很快被體內(nèi)自由基清除系統(tǒng)所清除。組織細(xì)胞缺氧使呼吸鏈傳遞電子的效能下降，不能產(chǎn)生足夠的電子使氧經(jīng)4價(jià)還原生成水。而是還原成為生成各種氧自由基。再灌注提供大量的氧，而線粒體呼吸鏈上的酶活性卻不能迅速增強(qiáng)，故線粒體是在灌注時(shí)自由基產(chǎn)生的主要來源（如圖7-1)。此外，Ca2+超載使線粒體
功能受損，細(xì)胞色素氧化酶系統(tǒng)被抑制，致使氧經(jīng)單電子還原成氧自由基增多；缺氧導(dǎo)致細(xì)胞中抗氧化酶活性降低，氧自由基清除減少，也是氧自由基增多的原因之一。
2．血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)黃嘌呤氧化酶形成增加 血管內(nèi)皮細(xì)胞中富含黃嘌呤酶類。正常時(shí)，黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XO)占10％，其前身黃嘌呤脫氫酶(xanthine dehydrogenase，XD)占90％。組織缺血時(shí)，由于Ca2+超載，激活Ca2+依賴性蛋白酶使XD轉(zhuǎn)化為XO，使XO大量增加；同時(shí)，由于ATP降解，次黃嘌呤生成增加。再灌注提供了大量的氧，使缺血時(shí)積聚的次黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶的作用下生成黃嘌呤，后者再在黃嘌呤氧化酶作用下生成尿酸，這兩個(gè)過程都有氧自由基生成(圖7—2)。
3．白細(xì)胞呼吸爆發(fā)產(chǎn)生大量活性氧 白細(xì)胞吞噬時(shí)伴耗氧量顯著增加的現(xiàn)象，稱呼吸爆發(fā)(respira—toryburst)。其攝取O2的70％～90％經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的NADPH氧化酶作用形成氧自由基(NADPH+02——NADPH氧化酶→NADP++ H+ + O2-)，用以殺滅病原微生物。組織缺血過程中大量中性粒細(xì)胞被激活，再灌注又提供大量氧，從而使活性氧大量增加。
4．兒茶酚胺的自身氧化 再灌注也是一種應(yīng)激狀態(tài)，此時(shí)交感—腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)會(huì)釋放和分泌大量兒茶酚胺，后者自氧化生成O2- 。
5．誘導(dǎo)型NOS表達(dá)增強(qiáng) 單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中含有iNOS。缺血再灌注導(dǎo)致白細(xì)胞活化后，iNOS表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致NO大量生成。NO及其代謝產(chǎn)物OONO-、HOONO和·OH都可導(dǎo)致組織損傷。
6．體內(nèi)清除活性氧的能力下降 生物體內(nèi)存在完整的抗氧化系統(tǒng)，包括：
(1)抗氧化酶類 如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)清除O2-，過氧化氫酶(catalase，CAT)清除H2O2，谷胱甘肽過氧化物酶(glutathioneperoxidase，GSHpx)清除H2O2，谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶清除脂性自由基等。
(2)非酶性抗氧化物 如維生素E、谷胱甘肽、清蛋白、銅藍(lán)蛋白等也可清除活性氧或控制活性氧的生成。
正常情況下活性氧不斷產(chǎn)生，又不斷被清除。活性氧的作用具有兩重性，一定濃度的活性氧參與生命活動(dòng)中的許多化學(xué)反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及基因調(diào)控；缺血—再灌注時(shí)，由于清除活性氧的能力下降及活性氧大量產(chǎn)生，則造成組織細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷。
(三)活性氧的損傷作用
活性氧能和膜磷脂、蛋白質(zhì)、核酸等多種細(xì)胞成分發(fā)生反應(yīng)，破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，造成細(xì)胞損傷。
l.膜脂質(zhì)過氧化 生物膜(細(xì)胞膜、線粒體膜、溶酶體膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜)是活性氧攻擊的主要部位。生物膜的主要成分是極性脂質(zhì)(磷脂、膽固醇)和膜蛋白(酶、受體、離子通道等)。膜磷脂富含多價(jià)不飽和脂肪酸，易發(fā)生脂質(zhì)過氧化。脂質(zhì)過氧化的直接后果是其不飽和性改變，繼之發(fā)生膜流動(dòng)性降低、脆性增加、膜受體和酶功能改變。嚴(yán)重醫(yī)學(xué)全.在線者可導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞內(nèi)容物外溢，細(xì)胞死亡。影響大小因膜本身的位置和功能而異。
(1)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞 細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化使細(xì)胞膜受體失活、離子通道變構(gòu)、酶活性改變，從而引起細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)變化(圖7—3)。
(2)細(xì)胞器膜結(jié)構(gòu)破壞 活性氧對(duì)細(xì)胞器膜脂質(zhì)攻擊結(jié)果是：①溶酶體破裂釋放溶酶體酶，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)損壞；②線粒體腫脹、功能障礙，產(chǎn)能減少；③肌漿網(wǎng)Ca2+—ATP酶活性降低使攝取的Ca2+減少，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載。
(3)脂質(zhì)信號(hào)分子生成異常 磷脂是細(xì)胞膜所特有的成分，其中肌醇磷脂在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中十分重要。雖然肌醇磷脂的脂質(zhì)過氧化不會(huì)影響膜的穩(wěn)定性，但卻會(huì)使前列腺素(PGs)、1，4，5—三磷酸肌醇(IP3)和甘油二酯(DG)等生成障礙，致使細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常。
2.蛋白質(zhì)失活 活性氧可以使蛋白質(zhì)分子氧化而發(fā)生變性、聚合、降解或肽鏈斷裂，從而使酶、受體、離子通道等產(chǎn)生功能障礙�；钚匝醯墓裟繕�(biāo)包括蛋白質(zhì)肽鏈中的蛋氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸等殘基，嚴(yán)重影響蛋白質(zhì)功能�；钚匝鯇�(duì)酶活性的影響包括：①破壞氧化酶的活性中心——巰基；②破壞酶活性所必需的脂質(zhì)微環(huán)境；③在酶蛋白之間發(fā)生交聯(lián)形成多聚物；④攻擊酶活性中心部位的氨基酸；⑤也可激活一些酶，如激活磷脂酶A2使膜磷脂釋放出花生四烯酸，導(dǎo)致前列腺素、白三烯生成增多，炎癥反應(yīng)加劇。
3．DNA損傷 活性氧對(duì)核酸的作用主要是堿基修飾、斷裂和交聯(lián)。造成DNA損傷的活性氧主要為·OH和NO。DNA損傷包括：
(1)細(xì)胞核DNA損傷 細(xì)胞核DNA是生物體遺傳信息的攜帶者，具有編碼蛋白質(zhì)的功能，決定著生物體的主要生命活動(dòng)。顯然，DNA損傷的危害是十分嚴(yán)重的。其主要損傷表現(xiàn)為：①堿基修飾：活性氧與堿基發(fā)生加成反應(yīng)，如·OH在胸腺嘧啶的5，6—雙鍵上進(jìn)行加成反應(yīng)，形成胸腺嘧啶自由基，從而改變了DNA的結(jié)構(gòu)，影響遺傳信息的正確表達(dá)；②DNA斷裂：·OH和NO從核酸的戊糖中奪取氫原子，使其形成在C4上具有未配對(duì)電子的自由基，然后在β—位發(fā)生鏈的斷裂，使核酸分子的完整性被破壞，導(dǎo)致遺傳突變；③DNA交聯(lián)：活性氧可使DNA—DNA、DNA—組蛋白之間形成共價(jià)結(jié)合，引起交聯(lián)。在雙股DNA鏈之間形成股間交聯(lián)，從而限制股間解鏈，導(dǎo)致DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄障礙，使遺傳信息表達(dá)受阻。 ·
(2)線粒體DNA損傷 線粒體不僅是體內(nèi)能源生產(chǎn)基地，同時(shí)還有自己的遺傳系統(tǒng)，線粒體DNA(mtDNA)編碼線粒體tRNA、rRNA及一些線粒體蛋白質(zhì)，如電子傳遞鏈酶復(fù)合體中的亞基等。線粒體DNA是裸露的，不與組蛋白結(jié)合，缺乏修復(fù)機(jī)制，且代謝轉(zhuǎn)換率高，因而極易受到自由基攻擊。線粒體DNA受損可導(dǎo)致線粒體的結(jié)構(gòu)和功能障礙。此外，線粒體與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。O2-和ON00-能導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，線粒體膜孔道開放，細(xì)胞色素C和其他凋亡因子溢出，進(jìn)而活化凋亡蛋白酶(caspase)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
4．細(xì)胞間基質(zhì)破壞 氧自由基可使透明質(zhì)酸酶降解、膠原蛋白交聯(lián)，從而使細(xì)胞間基質(zhì)變得疏松、彈性降低。
