實驗十二 厭氧芽胞梭菌
厭氧芽胞梭菌屬(Clostridum)中主要致病菌有破傷風梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌和艱難梭菌等。
破傷風梭菌(C.tetani)為專性厭氧菌，是破傷風的病原菌。
產(chǎn)氣莢膜梭菌(C.perfringens)是氣性壞疽的主要病原菌，多與其他病原梭菌混合感染導致氣性壞疽；也可污染肉類，引起食物中毒。
肉毒梭菌(C.botulinum)為專性厭氧菌，在厭氧環(huán)境中分泌毒性極強烈的外毒素(肉毒毒素)。人類誤食被肉毒毒素污染的食物后，將發(fā)生以運動神經(jīng)麻痹為主的肉毒中毒。
（一)形態(tài)與培養(yǎng)特性
【材料與方法】
1．破傷風梭菌革蘭染色片、產(chǎn)氣莢膜梭菌革蘭染色片、莢膜染色片、肉毒梭菌革蘭染色片。
2．觀察破傷風梭菌厭氧血瓊脂平板培養(yǎng)物和庖肉培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)物。產(chǎn)氣莢膜梭菌厭氧血瓊脂平板培養(yǎng)物和24～48h庖肉培養(yǎng)物。肉毒梭菌厭氧血瓊脂平板培養(yǎng)物和庖肉培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)物。
【結果】
1．破傷風梭菌為革蘭陽性細長桿菌；芽胞正圓形，位于菌體頂端，直徑大于菌體，使菌體呈鼓槌狀(圖12-1)。
圖12-1 破傷風桿菌純培養(yǎng)的鏡下形m.f1411.cn/shiti/態(tài)
產(chǎn)氣莢膜梭菌為革蘭陽性粗大桿菌，兩端鈍圓，單個或成雙排列；芽胞一般少見，芽胞橢圓形，直徑小于菌體，位于菌體中央或次極端。從人或動物體內(nèi)新分離者有莢膜。
肉毒梭菌為革蘭陽性粗短桿菌；芽胞橢圓形，粗于菌體，位于次極端，使細菌呈湯匙狀或網(wǎng)球拍狀。
2．破傷風梭菌在厭氧血瓊脂平板上形成較大(2～4mm)、扁平、邊緣不齊的菌落，有狹窄的β溶血環(huán)。部分菌落呈羽毛狀。
產(chǎn)氣莢膜梭菌在厭氧血瓊脂平板上形成較大(2～4mm)、圓形、光滑、邊緣整齊的菌落，多數(shù)菌株有雙層溶血環(huán)，內(nèi)環(huán)完全溶血，外環(huán)不完全溶血。
肉毒梭菌在厭氧血瓊脂平板上形成較大(2～6mm)、不規(guī)則、半透明、灰白色的菌落，有β溶血環(huán)。
3．破傷風梭菌在庖肉培養(yǎng)基中生長緩慢，厭氧培養(yǎng)2～7d，肉渣部分消化，微變黑，有少量氣體。
產(chǎn)氣莢膜梭菌在庖肉培養(yǎng)基中呈混濁生長，肉渣呈淡粉紅色，不被消化，產(chǎn)生大量氣體。
肉毒梭菌在庖肉培養(yǎng)基中生長旺盛，呈均勻混濁，肉渣被消化變黑色，有腐敗惡臭。
（二)洶涌發(fā)酵試驗
【材料與方法】
穿刺接種產(chǎn)氣莢膜梭菌于牛乳培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)18～24h，觀察結果。
【結果】
產(chǎn)氣莢膜梭菌能分解牛乳中的乳糖，產(chǎn)酸，使酪蛋白凝固，同時產(chǎn)生大量氣體，沖散凝固的酪蛋白，因此牛乳管中可看到凝固的蛋白和沖至管頂部的凡士林；這種氣勢兇猛的現(xiàn)象，一般培養(yǎng)6h后即可發(fā)生，稱“洶涌發(fā)酵”。此為鑒別本菌的特征之一。
附錄：
（一)溴甲酚紫牛乳培養(yǎng)基
成分：新鮮牛乳，1.6%溴甲酚紫酒精溶液。
制法：將新鮮牛乳分裝于沉淀管中，2000rpm離心15min。用虹吸管吸出乳汁，注入三角燒瓶中，除去乳脂。每1000ml牛乳加入溴甲酚紫1ml，分裝試管，間歇滅菌：第1日75℃30min，第2日80℃ 30min，第3日85℃30min，再于37℃www.med126.com中經(jīng)24～48h，無菌生長方可使用。
（二)肉渣培養(yǎng)基
制法：將制肉浸液剩下的肉渣裝入試管，每支2～3g。然后加入pH7.6的肉浸液約5ml，121℃ 30min 滅菌后備用。
（三)葡萄糖高層瓊脂培養(yǎng)基
成分：
牛肉膏 3g
蛋白胨 10g
氯化鈉 5g
葡萄糖 3～5g
瓊 脂 18～20g
水 1000ml
制法：上述各成分混合溶化后，121℃20min滅菌后，分裝于無菌試管，每支試管裝入的培養(yǎng)基需超過試管高度的3/5，經(jīng)37℃24～48h 孵育后若無菌生長即可使用，使用時加熱融化高層瓊脂，冷至45℃左右，種入?yún)捬蹙�，迅速混勻。冷凝�?7℃孵育，厭氧菌在管底處生長。
