實驗二十六 核酸擴增技術(shù)
最常用的核酸擴增方法是聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechain reaction，PCR)。
【原理】
PCR技術(shù)是在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核苷存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促反應(yīng)，是一種體外擴增特異DNA片段的方法，其特異性取決于引物和模板DNA結(jié)合的特異性。反應(yīng)分三步：①變性：加熱使雙鏈DNA解離成單鏈DNA。②退火：引物和其互補的模板DNA結(jié)合形成雜交鏈。③延伸：在DNA聚合酶的催化下。以引物為起始點的DNA鏈進(jìn)行延伸。以上三步為一個循環(huán)，每一循環(huán)產(chǎn)物可作為下一個循環(huán)的模板。數(shù)小時之后，介于兩個引物之間的特異性DNA片段得到了大量擴增，數(shù)量可達(dá)2×106~7拷貝。
【反應(yīng)成分】
1．引物(primer)是DNA聚合酶啟動DNA合成時所必需的一段寡核苷酸。
2．TaqDNA聚合酶。
3．反應(yīng)緩沖液 PCR反應(yīng)的緩沖液常用含10～50mmol/LTris·HCl，50mmol/L KCl2的溶液，聚合反應(yīng)溫度下pH為7.2，但各實驗室該緩沖液配方可能不同。
4．dNTPs、模板(靶基因)DNA。
【反應(yīng)體系】
標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系：（100μl)
10×擴增緩沖液 10μl
Mg2+(1.5mmol/L) 6μl
4種dNTP混合物(各200μmol/L) 2μl
上下游引物(各10～100pmol) 各2μl
模板DNA(0.1～2μg) 2～4μl
Taq DNA聚合酶(2.5u) &nbswww.med126.comp;1μl
加雙或三蒸水至 100μl
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【擴增流程】
一般PCR擴增流程：
94℃ (預(yù)中國衛(wèi)生人才網(wǎng)變性) 5min
94℃ (變性) 30s～1min
55～60℃ （退火) 30s～1min 30～35次循環(huán)
72℃ （延伸) 1～2min
72℃ （終延伸) 5～10min
4℃ （保溫)
