實(shí)驗(yàn)二十七 蛋白質(zhì)的分子檢測(cè)方法
每個(gè)菌細(xì)胞大約含有2000種的蛋白分子，這些蛋白質(zhì)參與了細(xì)菌的各種生命活動(dòng)，也構(gòu)成細(xì)菌的各種特征信息，因此在分類(lèi)學(xué)中已發(fā)展了許多技術(shù)，用來(lái)分離和研究蛋白質(zhì)的特征，以作為系統(tǒng)研究的依據(jù)。常用的蛋白質(zhì)的分子技術(shù)有十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE，sodiumdodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)、Western印跡法(Westernblot)等。
一、十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)
【原理】
將待測(cè)蛋白質(zhì)樣品溶解于含有強(qiáng)陰離子去污劑(SDS)和還原劑的溶液中，加熱使蛋白質(zhì)解離，變性的多肽與SDS結(jié)合，結(jié)合的量與多肽的分子量成正比，該SDS多肽復(fù)合物在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的遷移率也只與多肽的分子量大小相關(guān)。在飽和的狀態(tài)下，每克多肽約可結(jié)合1.4g去污劑，借助已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)參照物便可測(cè)算出多肽鏈的分子量。用考馬斯亮藍(lán)或銀鹽對(duì)聚丙烯酰胺液進(jìn)行染色，可清晰地顯示電泳后的蛋白質(zhì)圖m.f1411.cn譜。
【材料】
1．10%十二烷基磺酸鈉(SDS)、1.5mol/L Tris(PH8.8) 、1.0mol/LTris(PH6.8) 、10%過(guò)硫酸銨、30%丙烯酰胺溶液、四甲基乙二胺(TEMED)、滅菌去離子水、2×SDS凝膠加樣緩沖液、β-琉基乙醇。
2．5×儲(chǔ)存液(Tris堿9g；甘氨酸 43.2g；SDS 3g；用去離子水稀釋至600ml，調(diào)pH8.3，4℃儲(chǔ)存)。
3．溴酚藍(lán)、考馬斯亮藍(lán)染色液、脫色液。
【方法】
1．洗凈電泳玻板 用洗衣粉擦洗電泳玻板，自來(lái)水沖洗干凈后，用單蒸水沖洗后晾干。
2．裝板 將兩塊玻板對(duì)整齊，裝入。
3．配分離膠 根據(jù)所分離的蛋白分子量和玻板的大小分別選擇丙烯酰胺凝膠濃度和確定配膠體積。本實(shí)驗(yàn)選用10%丙烯酰胺凝膠(有效分離范圍約在16～68kDa)，分離膠體積10ml，按下列體積吸取各種儲(chǔ)存液：
滅菌去離子水： 3.3ml
30％丙烯酰胺溶液 4.0ml
1.5mol/LTris(PH8.8) 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)網(wǎng); 2.5ml
10％(SDS) 100μl
10％過(guò)硫酸銨 100μl
TEMED 4μl
混勻(注意不要產(chǎn)生氣泡)。
4．灌分離膠 將混勻的分離膠沿玻板壁緩緩加入兩塊玻板之間（注意不要產(chǎn)生氣泡)，注意分離膠只能加到一定高度(插入梳子離梳子1～1.5cm,以便加濃縮膠)，上面覆蓋一層滅菌去離子水,靜置20～30min。
5．配濃縮膠 按下列體積吸取各種儲(chǔ)存液，配制5ml濃縮膠：
滅菌去離子水： 2.7ml
30%丙烯酰胺溶液 0.67ml
1.0mol/LTris(PH6.8) 0.5ml
10%(SDS) 40μl
10%過(guò)硫酸銨 40μl
TEMED 4μl
混勻(注意不要產(chǎn)生氣泡)。
6．灌濃縮膠 待分離膠聚合后(20～30min),倒掉上層的水.將混勻的濃縮膠沿玻板壁緩緩加在分離膠上面,然后插上梳子,靜置20～30min。
7．樣品處理 本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IPTG(異丙基-D-硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)的重組蛋白。吸取100μl已培養(yǎng)表達(dá)的菌液于1.5mlEP管中，離心(5000rpm/min，2min)，棄上清，沉淀加入25μl2×SDS凝膠加樣緩沖液和3μlβ-琉基乙醇,煮沸7min(注意：EP管蓋須扎一針孔，以免沸液將管蓋沖開(kāi))。
8．配電泳緩沖液 取60ml5×電泳緩沖液,稀釋至300ml,即成1×電泳緩沖液。
9．加樣 待濃縮膠聚合后(20～30min),取出梳子,用電泳緩沖液清洗凝膠加樣孔.將兩塊玻板夾在電泳槽上,將電泳緩沖液倒?jié)M上下槽.用微量加樣注射器吸取20μl樣品,加到加樣孔底部,每加完一個(gè)樣品需用水清洗微量加樣注射器。樣品加完后如有剩余加樣孔，應(yīng)加上等體積的1×SDS凝膠加樣緩沖液。
10．電泳 將電泳槽與電泳儀相接，正極(紅色)接下槽。打開(kāi)電源，恒壓120V電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)前沿進(jìn)入分離膠，約20min，把電壓提高到200V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部(約80min)，關(guān)閉電源。
11．卸膠、染色、脫色 取出電泳玻板，卸下夾子，小心取出凝膠。將凝膠放入一器皿內(nèi)，倒入考馬斯亮藍(lán)染色液，放于平緩搖動(dòng)的脫色搖床上于室溫染色40min，倒出回收染色液，加入脫色液，平緩搖動(dòng)約30min可見(jiàn)藍(lán)色蛋白條帶。
12．凝膠成像 將已脫色的凝膠置于凝膠成像儀上拍照。
二、免疫印跡(Western blot)法
【原理】
將蛋白質(zhì)抗原樣品變性，SDS-PAGE電泳分離的蛋白組分從凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，利用抗原與抗體結(jié)合的特異性，與相應(yīng)的一抗孵育，用二抗放大一抗檢測(cè)到的信號(hào)，并顯示檢測(cè)信號(hào)，從而判斷膜上有無(wú)待測(cè)蛋白質(zhì)抗原的存在及量的多少。同時(shí)用蛋白質(zhì)分子量Marker，還可判斷待測(cè)蛋白質(zhì)抗原的分子量。
【材料】
1．SDS-PAGE電泳試劑(見(jiàn)SDS-PAGE)、2×上樣緩沖液(LoadingBuffer)、電轉(zhuǎn)緩沖液、TBS、TBS-T、封閉液(BlockingBuffer) 、分離膠，Whatman 3M濾紙。
2．生物素標(biāo)記的蛋白分子量Marker，一抗，二抗，化學(xué)發(fā)光試劑盒(AECKit)。
3．AECBuffer(AEC-3.35ml,0.1MAcetic-50ml,ddH2O2-50μl,filtrated with 2 membrane)。
【方法】
1．配制SDS-PAGE分離膠和濃縮膠。
2．取一定量蛋白質(zhì)樣品(使用前煮沸變性7min)，另取3～5μl生物素標(biāo)記的蛋白質(zhì)分子量Marker。
3．上樣。
4．電泳：濃縮膠中恒壓120V，電泳30min；分離膠恒壓160～200V，電泳80min。
5．卸下分離膠，用電轉(zhuǎn)緩沖液平衡洗滌1次，10min。
6．將硝酸纖維素膜(NC膜)在電轉(zhuǎn)緩沖液中平衡10min，Whatman3M濾紙也同時(shí)在電轉(zhuǎn)液中平衡。
7．電轉(zhuǎn)儀上的裝架：從負(fù)極到正極方向依次為：濾紙－膠－NC膜－濾紙，分別排除所有氣泡。
8．接通電源，恒壓100V，90min。
9．取出NC膜，用雙蒸水洗滌1次，10min。
10．封閉液封閉NC膜，4℃靜置過(guò)夜。
11．(第二天)：用TBST洗NC膜1次，10min。
12．用TBST稀釋相應(yīng)的一抗，與NC膜孵育1h，室溫輕柔搖動(dòng)。
13．用TBST洗滌5次，分別為1，2，3，4，5min。
14．用TBST稀釋相應(yīng)的二抗，與NC膜孵育1h，室溫輕柔搖動(dòng)。
15．用TBST洗滌5次，分別為1，2，3，4，5min。
16．用TBST稀釋AB復(fù)合物，與NC膜孵育1h，室溫輕柔搖動(dòng)。
17．用TBST洗滌5次，分別為1，2，3，4，5min。
18．準(zhǔn)備AECBuffer，NC膜加入AEC Buffer中，待其顯色。
19．用雙蒸水洗滌NC膜2次，晾干。
