李健，副主任醫(yī)師，第三軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)士，畢業(yè)后在解放軍總醫(yī)院先后從事臨床血液學(xué)、體液學(xué)和免疫學(xué)檢驗(yàn)，先后參編《血細(xì)胞分析技術(shù)與臨床》、《貧血，血栓與遺傳學(xué)檢驗(yàn)與臨床應(yīng)用》和《當(dāng)代血液分析技術(shù)與臨床》等七部學(xué)術(shù)專著。碩士期間于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院參與國家863項(xiàng)目（2002AA2Z3411)資助的藥物代謝酶基因芯片的研究與制備，對芯片制備與信號檢測、探針和引物的設(shè)計(jì)合成及多重?cái)U(kuò)增有深入了解。博士研究師從叢玉隆教授，方向?yàn)榭寡“逯委熕幬锬褪艿难“寤罨鷥敊C(jī)制。近年來致力于抗栓溶栓藥物的臨床療效評估與實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)化的相關(guān)研究。
伴隨著人們生活水平的提高，心血管疾病發(fā)病率和病死率也成逐年增高的趨勢，血栓栓塞性疾病做為多種系統(tǒng)疾病的并發(fā)癥成為臨床醫(yī)學(xué)的研究重點(diǎn)。近年來，血栓止血學(xué)臨床檢驗(yàn)在出血性疾病的診斷、術(shù)前檢查和抗凝治療檢測中得到了廣泛應(yīng)用。受益于檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的迅猛發(fā)展，自動(dòng)化凝血儀的普及大大提高了檢測效率，降低了系統(tǒng)誤差，使檢測結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度達(dá)到前所未有的水平。然而，當(dāng)前國內(nèi)血栓學(xué)常規(guī)檢驗(yàn)中仍然存在著一些誤區(qū)，除了方法學(xué)本身的問題之外，缺乏對項(xiàng)目和檢測原理的理解，也是造成目前參數(shù)使用不當(dāng)、實(shí)驗(yàn)室難以向臨床提供有力支持的主要原因。本文圍繞血栓學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)容從三個(gè)方面加以討論。
一、凝血檢驗(yàn)的校準(zhǔn)化與可比性
從PT和APTT檢測方法建立以來，相關(guān)學(xué)者就一直致力于這兩個(gè)參數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化，迄今為止，只有PT實(shí)現(xiàn)了部分標(biāo)準(zhǔn)化，也就是抗凝治療監(jiān)測中INR系統(tǒng)的應(yīng)用；而APTT的標(biāo)準(zhǔn)化仍然停留在探索階段。
（一)抗凝治療監(jiān)測中PT的標(biāo)準(zhǔn)化
由于凝血活酶試劑活性的差異以及報(bào)告方式的不同，抗凝治療的患者在不同實(shí)驗(yàn)室得到的PT往往不具有可比性，不能用于抗凝治療藥物的調(diào)整。為此，1977年世界衛(wèi)生組織將人腦來源的凝血活酶作為一級國際參考品（IRP)來校準(zhǔn)凝血活酶試劑。并將PT以INR的形式表示，INR=（PT/MNPT)ISI，其中ISI為凝血活酶的國際敏感度指數(shù)，MNPT為正常人凝血酶原時(shí)間的幾何均數(shù)，這種校準(zhǔn)方式大幅提高了手工檢測時(shí)不同試劑之間的檢測標(biāo)準(zhǔn)化。
（二)自動(dòng)化凝血儀的多樣性使報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)化再次面臨困境
INR的方式提高了實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的有效性和口服抗凝治療的安全性，在各大臨床指南中都可以發(fā)現(xiàn)以INR為監(jiān)測目標(biāo)的診治措施。今天，我們必須明確的是INR概念和校準(zhǔn)方式的提出是基于手工方法的，當(dāng)自動(dòng)化凝血儀被普及使用之后，INR概念的內(nèi)涵發(fā)生了更為復(fù)雜的改變。儀器測試原理與手工法顯著不同，對凝血活酶ISI以至INR產(chǎn)生較大的影響而且程度不確定，機(jī)械和終點(diǎn)判定等因素破壞了INR體系原有的可靠性和精密度。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，同一廠家的相同機(jī)型對INR的影響都有顯著差異，儀器校正顯得十分必要。
必須明確：INR是WHO利用IRP標(biāo)定凝血活酶試劑后，手工測定PT時(shí)優(yōu)化報(bào)告的一種方法和理念，這時(shí)可以減少室間差異及提高報(bào)告的可比性。凝血活酶校準(zhǔn)時(shí)要求使用參考品和試管傾斜方法判定結(jié)果，然而，將商品化凝血活酶在自動(dòng)化凝血儀上檢測標(biāo)本時(shí)，原理發(fā)生了改變，這種校準(zhǔn)方法的基礎(chǔ)已經(jīng)不復(fù)存在了。這時(shí)我們校準(zhǔn)的不僅僅是凝血活酶，而是包括凝血活酶和檢測技術(shù)（儀器)在內(nèi)的整個(gè)系統(tǒng)。
如果不用標(biāo)準(zhǔn)血漿校準(zhǔn)，數(shù)據(jù)顯示實(shí)驗(yàn)室間的INR差異具有顯著性，波動(dòng)幅度（CV%)大約為9～17%，僅60%的實(shí)驗(yàn)室在10%以內(nèi)。即便使用同種試劑，同類型儀器測定的INR也有較大差異。原因之一就是很多研究誤以為ISI只針對試劑，實(shí)際上，一個(gè)固定的ISI未必適合所有機(jī)型，如果不考慮儀器差異而泛泛考察可比性，將導(dǎo)致試劑校準(zhǔn)和系統(tǒng)校準(zhǔn)的混淆。自動(dòng)化凝血儀的檢測系統(tǒng)往往包括幾個(gè)部分：正常血漿、抗凝患者血漿、凝血活酶試劑、檢測技術(shù)（手工法和不同類型的凝血儀)。試劑對標(biāo)本類型差異會(huì)產(chǎn)生不同反應(yīng)，比如，某試劑在自動(dòng)化凝血儀上與IRP手工法對比測定正常和高值兩組標(biāo)本時(shí)，可能回歸曲線的斜率很接近，但是截距有差異，也就是試劑相關(guān)性較好，但是在不同值段的測定結(jié)果有差異。臨床實(shí)踐中不可能對正常和抗凝患者的標(biāo)本建立兩條工作曲線，所以應(yīng)盡量選擇性能表現(xiàn)均一的試劑。
（三)要嚴(yán)格限定試劑ISI的適用范圍
為了避免混亂，通過多年研究和專家的倡導(dǎo)，國外制造商已經(jīng)在其說明書中提供儀器型號特異的凝血活酶ISI，便于用戶使用；但是要提供所有儀器和不同試劑組合的ISI顯然是不可能的。更讓人頭疼的是，制造商為每一批凝血活酶試劑提供的ISI不一定很準(zhǔn)確，定標(biāo)血漿使用不當(dāng)進(jìn)而導(dǎo)致INR的校準(zhǔn)偏差。
凝血活酶制品校準(zhǔn)的準(zhǔn)確性取決于口服華法令患者標(biāo)本的數(shù)量，WHO推薦的用IRP校準(zhǔn)凝血活酶試劑的方法需要測定至少20份新鮮正常血和60份新鮮抗凝治療的血樣。許多廠家難于收集到足夠數(shù)量的標(biāo)本，無法得到準(zhǔn)確的ISI，受害的不單是實(shí)驗(yàn)室，更多的是患者的利益。
是否選用同物種的IRP來校準(zhǔn)凝血活酶，也是ISI標(biāo)注的關(guān)鍵，人源和兔源IRP校準(zhǔn)的凝血活酶在檢測性能上是不同的。1977年以后WHO陸續(xù)改良更新了幾個(gè)物種和不同級別的凝血活酶參考品，雖然WHO生物標(biāo)準(zhǔn)化專家委員會(huì)提出所有商品化凝血活酶都應(yīng)以同一物種的國際參考品校準(zhǔn)，甚至有專家認(rèn)為應(yīng)該都以人腦參考品校準(zhǔn)，以減少物種之間的差異，但是據(jù)筆者觀察，多數(shù)產(chǎn)品說明書中都沒有校準(zhǔn)方法的詳細(xì)表述，這就為單純追求低成本而不加選擇地?fù)Q用試劑埋下了隱患。www.med126.com
此外還有生物參考范圍不同的問題。理論上，使用系統(tǒng)特異的ISI計(jì)算的INR應(yīng)該是相當(dāng)接近的，然而，由于校準(zhǔn)方式不當(dāng)和生物多樣性的存在，INR的值也有出入，比如各實(shí)驗(yàn)室MNPT不同，凝血活酶生產(chǎn)商標(biāo)定自己產(chǎn)品ISI時(shí)使用的方法不同等。
這些不利因素就對凝血實(shí)驗(yàn)室提出了較高要求，但是自行校準(zhǔn)也缺乏可行性。醫(yī)院測定MNPT還相對容易，但是按照WHO的推薦方法對凝血儀和試劑組成的系統(tǒng)來校準(zhǔn)ISI并非易事。多數(shù)實(shí)驗(yàn)室直接使用了試劑標(biāo)注的ISI，甚至有的ISI不是針對自己的機(jī)型。而且即便是校準(zhǔn)了ISI，也只能出來報(bào)告之后再編輯程序批量計(jì)算校準(zhǔn)后的INR。據(jù)筆者了解，目前在國內(nèi)主流機(jī)型上通過調(diào)整ISI實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)校準(zhǔn)難度較大。因此，要么在實(shí)驗(yàn)室信息系統(tǒng)（LIS)中增加數(shù)據(jù)處理的程序語句，要么計(jì)算INR后再手工輸入，這種方式推行起來有困難。
（四)止凝血檢驗(yàn)中的校準(zhǔn)和定標(biāo)辨析
先是校準(zhǔn)試劑，接著又校準(zhǔn)試劑和儀器所組合成的系統(tǒng)，但是，我們?nèi)匀粵]有全面考慮到包括測試環(huán)境的所有因素。比如說粘度法中磁珠的差異，離心比濁法儀器中離心力的差異，光學(xué)比濁中的光徑，凝集曲線的特異性，電子和機(jī)械部件上差異等等，不一而足，任何因素不一致都會(huì)使結(jié)果受到影響。任何一種方法的結(jié)果都是根據(jù)定標(biāo)曲線和檢測信號確定的，儀器之間不僅信號不同，定標(biāo)曲線更是千差萬別。盡管常規(guī)工作中的定標(biāo)通常表述為Calibration，但是這并不是嚴(yán)格意義的校準(zhǔn)。定標(biāo)曲線的建立是為了在本實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下保持檢測體系穩(wěn)定的一種方式，只是一個(gè)檢測平臺，用于保證實(shí)驗(yàn)室對某一人群標(biāo)本測定的一致性。這個(gè)過程中沒有真正的標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)，如果定標(biāo)血漿未經(jīng)IRP校準(zhǔn)，那么該定標(biāo)是不能溯源的，定標(biāo)后的不同儀器未必具有可比性，系統(tǒng)差異的存在也不能通過定標(biāo)來消除。由于儀器性能上的差異性，簡單地用校正因子來調(diào)整檢測系統(tǒng)的方法是無效的。
APTT的標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程更為困難。檢測系統(tǒng)類型、接觸活化因子以及試劑磷脂成份的差異會(huì)導(dǎo)致APTT反應(yīng)的差異。1995年國際上提議建立APTT標(biāo)準(zhǔn)化的校準(zhǔn)模型，而目前還沒有適用于APTT的國際標(biāo)準(zhǔn)品，1998年Van Den Besselaar教授提出可以將含有合成磷脂和膠質(zhì)硅的凍干APTT試劑作為候選的APTT國際標(biāo)準(zhǔn)品。Clauss法Fib定量的定標(biāo)曲線可以溯源到參比血漿，因此這種方法可以實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化, 而PT衍生法是根據(jù)濁度變化換算結(jié)果，不僅與真實(shí)濃度存在偏差而且也不能標(biāo)準(zhǔn)化。
