三、應用地高辛標記rRNA探針的電鏡原位雜交技術
�。ㄒ�)基本原理
在地高辛標記核酸探針廣泛用于光鏡水平的原位雜交試驗并獲極為滿意的結果后，科學工作者試圖將其應用于電鏡水平。其基本原理和生物素標記核酸探針-PA-Gold電鏡雜交技術的基本原理相似，首先利用地高辛修飾核酸探針，與細胞或組織進行雜交，再用抗地高辛抗血清相連膠體金與之結合，進行細胞或組織特異核苷酸的超微結構定位。為增強金的顯示效應，可用銀加強法增強金粒的顯示效應。
�。ǘ�)基本操作方法（Fischer D et al, 1992)
1．組織處理
�。�1)固定：固定劑采用4%多聚甲醛（PFA，用PBS配制)加0.5%戊二醛（GA)，保存在4℃。作者采取浸入法，即取大鼠肝臟放入冷固定劑中（4%PFA，不含GA)，切成1mm3左右的小方塊。修整好的組織塊移入另一玻皿中，內盛有4%PFA和0.5%GA,固定2h。
�。�2)PBS（4℃)漂洗3～5min。
�。�3)脫水
時間乙醇濃度溫度
2×15min 30% 4℃
30min 30% 4℃
30min 50% -20℃
2×30min 70%，90%，96%，100% -20℃
注意勿使酒精揮發(fā)致使組織干燥。
（4)浸透和包埋（Carlemalarm et al, 1989)：由于K4M包埋劑有揮發(fā)性，因此，此步操作者必須帶手套，在通風柜中進行，注意K4M包埋劑不要靠近O2，一切在低溫下進行，最好設有恒低溫的冷柜。
①Lowcryl K4M配方
1)交聯(lián)劑A 2g
2)單體B 13g
3)引發(fā)劑 0.075g
混合1)，2)后，再加“3)”輕攪勻，混勻后置于-20℃。
�、诮福╥nfiltration)，在-20℃進行
時間液體
1h 100%乙醇：K4M（1：1，V/V)
2×1h K4M
過夜 K4M
2×3h K4M
③包埋： 先將膠囊冷卻，滴入幾滴K4M，然后每個膠囊內放入一個組織塊，以K4M充滿膠囊，在室溫放置30min，使包埋劑中氣泡逸出。然后置于0℃-40℃之間，利用紫外線燈360nm波長照射5天，溫度必須保存恒定。然后移至室溫使溫度回升，膠囊變硬。
�、芮衅河捎谀z囊是透明的，包埋在內的肝組織很容易識別。修塊后進行切片，由于K4M是親水性的，在切片過程中注意組織塊表面一定不要讓水浸濕，用200個網眼的鎳網覆以For－mvar膜和碳膜撈取切片，空氣干燥備用于雜交。
2．探針準備rRNA探針以Dig-UTP標記，注意探針不宜過長，否則影響對組織的穿透性。如過長，可事先用第二十章 介紹的探針水解法處理。
3．雜交本步驟均在濕盒內進行，將雜交液滴滴于蠟膜上，將鎳網載有切片面覆于液滴上，在65℃雜交至少3h。雜交液含：5×SSC，0.1mg/ml tRNA,Dig-UTP反意探針10ng/μl(et 1×SSC配，含150mmol/L NaCl, 15mmol/L醋酸鈉)。
4．雜交后漂洗 在室溫用2×SSC漂洗3×5min，然后用PBST（PBS,0.1%Tween)漂洗2×10min。
5．顯示
①以PBST加BT封閉（BT配方：PBST，1%BSA)孵育15min。
�、趹每沟馗咝量贵w結合直徑1mm的金粒，以PBST加BG稀釋為1：30，室溫孵育1h。
③以PBST漂洗3×5min。
�、芤詭ЧP尖嘴軟塑料壺沖洗6×15min。
�、菀糟y增強法，在暗室中孵育于顯影液：促進液（Enhancer)1：1,4～20min。
�、拗貜廷堋�
�、咭�2%醋酸鈾（4min)，枸緣酸鉛1min染色，漂洗，空氣干燥。
⑧電鏡觀察。
四、結語
原位分子雜交技術在電鏡水平的應用，或簡稱為電鏡原位分子雜交技術是基因表達在超微結構定位的一項極有前景的新興技術。但要使之完善，還需要做許多工作。必須說明的是電鏡原位雜交技術和光鏡原位雜交技術一樣必須設置對照實驗組，對顯示的結果的解釋應持審慎的態(tài)度。一般應在重復多次實驗的基礎上才能得出對本實驗的結論，不能只憑一次實驗或一張電鏡照片就勿忙結論。因原位雜交技術是高度敏感、高度特異性技術，影響因素很多。電鏡原位雜交技術的影響和干擾因素更多。相信在不久的將來，隨著電鏡原位雜交技術的廣泛應用，科技工作者將從實踐中對本技術的實驗流程不斷完善并有更多的新的電鏡原位雜交技術方法涌現。
