（三)猴病毒40（SV40)
猴病毒40（SV40)的基因組常用來作為克隆載體，把外源DNA轉(zhuǎn)入哺乳類細(xì)胞。猴病毒40是球形動物病毒，直徑40nm，呈20面體，有一個共價閉環(huán)的雙鏈DNA基因組，全長5244bp。它在猴腎中增殖。被SV40感染的細(xì)胞都會出現(xiàn)SV40的T抗原。早已證明完整的小鼠染色體β珠蛋白基因（包括所有的間插順序和兩側(cè)順序)整合在SV40中后，在被感染的猴腎細(xì)胞中都能正確地轉(zhuǎn)錄和翻譯。表明猴腎細(xì)胞的拼接系統(tǒng)能有效地處理小鼠β珠蛋白的初級轉(zhuǎn)錄本。
可是，SV40作為克隆載體有其局限性：①SV40基因組的晚期功能區(qū)的裂解性，不利于外源DNA的重組和表達(dá)；②早期功能區(qū)與病毒的致癌性有關(guān)，使用時有顧慮；③重組DNA片段的大小受體限制。
（四)逆轉(zhuǎn)錄病毒
逆轉(zhuǎn)錄病毒是RNA病毒，它有三個基因：gag-編碼病毒的核心蛋白；pol-編碼逆轉(zhuǎn)錄酶；env-編碼病毒的被膜糖蛋白。有的逆轉(zhuǎn)錄病毒還帶有癌基因（vonc)，即有的逆轉(zhuǎn)錄病毒有致癌作用。近年來，已設(shè)計構(gòu)建成一些缺陷型病毒（defective virus)使逆轉(zhuǎn)錄病毒成為有用的基因載體，成功地把抗藥性基因轉(zhuǎn)入了人體造血前體細(xì)胞，并在細(xì)胞中表達(dá)。Hock等選用了缺失編碼病毒外殼蛋白基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒，因此不能合成自身的外殼，但它有識別外殼蛋白進行包裝的信號（一段尚未鑒定的DNA順序)。用這種缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒去感染某種細(xì)胞株，這種細(xì)胞株包含有輔助病毒（helper virus)。輔助病毒能合成蛋白外殼，但缺失了識別蛋白外殼進行包裝的信號，因此它不能包裝成病毒顆粒。當(dāng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細(xì)胞株后，逆轉(zhuǎn)錄病毒的RNA進入輔助病毒的外殼蛋白，成為病毒顆粒。這時把受感染的細(xì)胞同骨髓細(xì)胞一起培養(yǎng)，包裝在輔助病毒外殼蛋白中的逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA，進入骨髓細(xì)胞，病毒DNA插入宿主細(xì)胞基因組，基因的活性得到表達(dá)。這時，由于骨髓細(xì)胞里面沒有輔助病毒，所以整合進宿主基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒，不再有外殼蛋白可供包裝，因此也就無法增殖，而只能被“陷”在宿主基因組中，通過細(xì)胞分裂而傳給下一代子細(xì)胞。
三、柯斯質(zhì)粒
1978年Collins和Hohn構(gòu)建一種新型的大腸桿菌克隆載體，命名為cosmid（柯斯質(zhì)粒)。它是用正常的質(zhì)粒同噬菌體λ的cos位點構(gòu)成。例如，柯斯質(zhì)粒pHC79系由質(zhì)粒pBR322和噬菌體λ的cos位點的一段DNA構(gòu)成（圖23-5)，全長43.kb。在包裝時，cos位點打開而產(chǎn)生噬菌體λ的粘性末端。由于pHC79有pBR322DNA，所以也就有氨芐青霉素抗性和四環(huán)素抗性兩個標(biāo)記。圖23-5說明了克隆基因時有用的限制酶切點。所以可以說柯斯質(zhì)粒是一類特殊的重組質(zhì)粒。
圖23-5 柯斯質(zhì)粒pHC79
設(shè)計構(gòu)建的柯斯質(zhì)粒一般長4～6kb。其上的cos位點的一個重要作用是識別噬菌體的外殼蛋白。凡具有cos位點的任何DNA分子只要在長度相當(dāng)于噬菌體基因組，就可以同外殼蛋白結(jié)合而被包裝成類似噬菌體λ的顆粒。因此，插入柯斯質(zhì)粒的外源DNA可大于40kb。重組的柯斯質(zhì)�？上笫删wλ一樣感染大腸桿菌，并在細(xì)菌細(xì)胞中復(fù)制。如把宿主菌在含氯霉素的培養(yǎng)基中生長，柯斯質(zhì)粒可以擴增到宿主細(xì)胞DNA總量的50%左右。
采用柯斯質(zhì)粒作載體的困難是：①載體自身只相當(dāng)于可以插入片段的1/10左右，因此往往會出現(xiàn)載體同載體自身連接，結(jié)果在一個重組分子內(nèi)可有幾個柯斯質(zhì)粒載體連在一起。但用堿性磷酸酶處理，可阻止載體分子自身連接；②大小不等的外源片段相互連接后插入同一個載體分子，結(jié)果使在基因組內(nèi)本來不是相鄰的片段錯亂地連接成一個片段，會影響實驗結(jié)果的分析，后來專門選出30～45kb的外源DNA插入載體DNA，此時，每個載體只可能插入一個外源片段，因為如果二處片段，則將超過包裝成噬菌體顆粒的限度；③細(xì)菌的菌落體積遠(yuǎn)大于噬菌斑，因此如用柯斯質(zhì)粒制備基因文庫，則篩選所需的含某一DNA片段的菌落很費時間�，F(xiàn)雖建立了高密度菌落篩選法，但由于柯斯質(zhì)粒制成的基因文庫常常不太穩(wěn)定，插入的大片段外源DNA有可能通過同宿主基因組交換而致丟失等，所以最常使用的還是噬菌體載體。
現(xiàn)將上面提到的四種載體作一比較（表23-3)
表23-3 四種載體的比較
| 質(zhì)粒 | λ噬菌體 | 柯斯質(zhì)粒 | 單鏈?zhǔn)删w | |
| 克隆DNA大片段 | ±* | + | + | - |
| 構(gòu)建基因組文庫 | - | + | + | - |
| 構(gòu)建cDNA文庫 | + | - | - | - |
| 常規(guī)的亞克隆化 | + | - | - | - |
| 構(gòu)建新型的DNA結(jié)構(gòu) | + | - | - | - |
| 序列分析 | + | - | - | + |
| 單鏈探針 | +** | - | - | + |
| 外源基因在大腸桿菌中的表達(dá) | + | - | - | - |
* 外源DNA如超過10kb，則重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率和DNA得率都非常低
** 已有個別質(zhì)料可用于此目的
