一、基本原理
很早以前，人們就注意到給動物飼以大量的雞蛋白，會引起明顯的“維生素H缺乏癥”，也稱為“蛋白質(zhì)傷害”。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在雞蛋白中含有一種堿性蛋白，分子量為68000，屬于糖蛋白，當(dāng)時命名為卵白素（Avidin)，卵白素具有4個同維生素H（Riotin,又名生物素)親合力極高的結(jié)合點(diǎn)。給動物飼以大量雞蛋白所致的維生素H缺乏，就是由于卵白素和大量的維生素H結(jié)合所致。維生素H（以下統(tǒng)稱生物素)是一種小分子的維生素，分子量為244，系轉(zhuǎn)氨甲�；^程中的輔酶，它與卵白素之間有很強(qiáng)的親合力，較之抗體對抗原的親合力要高出100萬倍，能夠彼此牢固結(jié)合而不影響彼此的生物學(xué)活性。同時，生物素與卵白素都具有與其它示蹤物質(zhì)如熒光素、鐵蛋白和過氧化酶等相結(jié)合的能力。免疫細(xì)胞化學(xué)工作者利用上述特性，建立了卵白素—生物素免疫染色系統(tǒng)。由于維生素H習(xí)慣上稱為生物素，為便于理解，現(xiàn)在譯名上統(tǒng)稱卵白素為抗生物素或親合素。所以卵白素—生物素免疫染色系統(tǒng)又稱為抗生物素—生物素免疫染色法。
二、幾中抗生物素—生物素染色法
1．抗生物素—生物素—過氧化酶復(fù)合物技術(shù)（Avidin Biotin –Peroxidase Complex technique, 簡稱ABC技術(shù))
�。�1)基本原理：ABC法是Hsu 等于1981年在HRAB法和LAB法的基礎(chǔ)上改良的，其特點(diǎn)是利用抗生物素分別連接生物素標(biāo)記的第二抗體和生物素標(biāo)記的酶。與LAB法和BRAB法不同的是第一抗體不為標(biāo)記物所標(biāo)記，生物素標(biāo)記的第二抗體與ABC復(fù)合物相連接。復(fù)合物是將過氧化酶結(jié)合在生物素上、再將生物素—過氧化酶連接物與過量的抗生物素蛋白反應(yīng)而制備的（圖6-1)，最后進(jìn)行顯色反應(yīng)定位。
圖6-1 ABC法
�。�2)操作步驟
①冰凍切片或石蠟切片均可。
②冰凍切片可用丙酮固定10min左右，0.01mol/l PBS (pH 7.2～7.6) 洗5min，更換3次。石蠟切片需經(jīng)脫蠟，系列酒精至水。
�、鄣谝豢贵w，室溫孵育15min。
④PBS洗5min，更換3次。
�、菁由锼貥�(biāo)記的第二抗體（1：200左右)，孵育15min。
�、轕BS洗5min，更換3次。
�、呒覣BC復(fù)合物室溫作用15min 。
�、郟BS洗5min，更換3次。
�、嵊肈AB—H2O2液（配法見附錄)顯色。
�、鈴�(fù)染。
�、戏馄�、觀察。
ABC復(fù)合物的配制：經(jīng)試驗，生物素與抗生物素之比為1：4時，能獲得最佳滿意效果。即抗生物素10μg/ml加2.5μg/ml生物素，應(yīng)用0.05mol/l Tris—HCl液，pH7.6，在應(yīng)用前30min配制。
